Doktor Falke (Holger Juul Hansen) hævner sig på sin ved Gabriel von Eisenstein (Poul Reichhardt), fordi denne efter et karneval har ladet ham ligge tilbage i en park – forklædt som flagermus, så han om morgenen bliver til grin for det gode borgerskab. Falke griber lejligheden til hævn, da Eisenstein har bragt sig selv i en kedelig situation ved at blive idømt ti dages fængsel for respektløs omtale af en fyrstelig person. Den stenrige russiske Prins Orloffsky (Grethe Mogensen) har bedt doktor Falke om at arrangere underholdningen ved sin store fest – og i denne overdådige ramme gennemfører Falke sin hævn. Han udnytter Eisensteins lyst til fest og flirt og bringer en mængde personer, til med og uden deres vidende, at “fange” Eisenstein i et net af intriger, forklædninger og maskeringer. Eisensteins hustru Rosalinde (Lily Broberg), hendes beundrer Alfred (Dario Campeotto), Adele (Ghita Nørby), hendes kammerpige, Adeles søster (Birgit Sadolin), fængselsdirektør Frank (Karl Stegger), betjent Frosch (Poul Hagen), advokat Blind (Ove Sprogøe), dommere, skrivere og hele det diplomatiske korps. Alle bærer handlingen frem til fejende, festlig musik, coupletter, duetter, terzetter, valse og kor, til den lykkelige slutning: Endelig kan Eisenstein – der er fortumlet af flirt, vin, forelskelse og jalousi – “befries” af “Flagermusen”s net – til det det væld af toner, der har gjort “Flagermusen” til operetterens dronning.
